Ugotavljanje poti širjenja hude gnilobe čebelje zalege z genetsko tipizacijo sevov povzročitelja bolezni

Faze projekta

Čebelarstvo ima v Sloveniji dolgoletno tradicijo. Po eni strani lahko govorimo o pomembni kmetijsko-gospodarski panogi, po drugi strani pa ima čebelarstvo edinstveno vlogo pri ohranjanju kulturne dediščine naroda. Glavni namen čebelarstva je še vedno pridobivanje čebeljih pridelkov (med, cvetni prah, propolis, vosek, matični mleček in čebelji strup), ki so nepogrešljivi v prehrani ljudi in imajo dokazano pozitivne učinke na zdravje, uporabljajo pa se tudi v farmacevtski industriji. Poleg tega je zelo pomembna tudi proizvodnja čebeljih matic in izdelava čebelarskega orodja. Čebele imajo izredno pomembno vlogo tudi pri opraševanju kulturnih rastlin ter s tem neprecenljiv gospodarski in naravovarstveni pomen v širšem smislu. Vse bolj pomembna dejavnost v Sloveniji, povezana z edinstveno čebelarsko dediščino in kulturo, je tudi čebelarski turizem.

V Sloveniji je dovoljeno čebelariti samo s kranjsko sivko Apis melifera carnica, avtohtono čebeljo pasmo, ki ima značilne ugodne morfološke in etološke lastnosti. V Sloveniji imamo posebna vzrejališča in plemenilne postaje, ki služijo za vzrejo matic avtohtone kranjske sivke. Pomemben cilj čebelarstva je tudi povečanje odpornosti čebel proti boleznim. Čebelje družine so podvržene številnim nalezljivim boleznim, med katerimi sta gospodarsko najpomembnejši predvsem varoza in huda gniloba čebelje zalege.

Huda gniloba čebelje zalege (ang. American foulbrood, AFB) je zelo nalezljiva in ena izmed najhujših bolezni čebelje družine, ki se pojavlja predvsem na območjih, v katerih živi medonosna čebela (A. melifera). Povzročitelj bolezni je po Gramu pozitivna, sporogena bakterija Paenibacillus larvae, ki prizadene zelo mlade čebelje ličinke, medtem ko odrasle čebele za povzročitelja niso občutljive. Ličinke se okužijo s sporami P. larvae preko kontaminirane hrane. Spore v svetlini srednjega črevesa ličinke vzklijejo, bakterije se močno namnožijo, vdrejo v hemolimfo ter povzročijo smrt ličinke. Mrtvo ličinko povzročitelj razgradi v vlecljivo maso, ki se kasneje posuši v suho lusko z milijoni spor. Le-te so zelo odporne proti številnim okoljskim dejavnikom in lahko ostanejo infektivne več desetletij. Zaradi bolezni se pojavi hudo pomanjkanje zalege, bolne čebelje družine oslabijo in popolnoma propadejo.

Okužba s P. larvae lahko v čebelji družini več mesecev poteka prikrito, v tem času pa se povzročitelj neovirano širi. Za uspešno zatiranje hude gnilobe je najučinkovitejši ukrep uspešno preprečevanje širjenja bolezni. V skladu s Pravilnikom o ukrepih za ugotavljanje, zatiranje, obveščanje in preprečevanje hude gnilobe čebelje zalege bolezni ne smemo zdraviti in jo je po zakonu potrebno prijaviti. Zatiranje bolezni vključuje neškodljivo uničenje okuženih čebeljih družin, kontaminiranih panjev in satja ter opreme, ki je ni mogoče razkužiti. V redkih primerih, pri družinah v prizadetem čebelnjaku, ki ne kažejo znakov bolezni in pri močnih družinah, kjer je bolezen še v začetnem stadiju, je dovoljeno pretresanje čebel. Ker se bolezen pogosto širi z nenadzorovanimi premiki čebel, je v Sloveniji eden izmed ukrepov zatiranja hude gnilobe uvedba trikilometrskega pasu okrog žarišča bolezni (t.i. kužni krog). Na tem območju velja prepoved premikov čebel, dokler se žarišče ne sanira in se pregledajo vse čebelje družine znotraj zapore. V kolikor se znotraj zapore ugotovi novo žarišče, se zapora ustrezno razširi. Vse to lahko traja več mesecev in povzroča dodatno ekonomsko škodo čebelarjem zaradi onemogočenega prevoza čebel na pašo ter prepovedi trgovine z maticami in čebeljimi družinami. Med državami obstajajo razlike v predpisih za zatiranje hude gnilobe, predvsem v velikosti pasu, znotraj katerih se uvede prepoved premikov čebel. V Sloveniji je zakonsko določena zapora trikilometrskega pasu okrog žarišča na osnovi preletne razdalje čebel.

Bakterijo P. larvae lahko dokazujemo v ostankih spremenjene zalege, v medu in tudi v ostalih čebeljih proizvodih. Sum na bolezen se postavi na podlagi značilnih kliničnih znakov, kot so presledkasta zalega, s temnimi, vdrtimi, preluknjanimi pokrovci in vlecljivo maso v satnih celicah. Diagnostika bolezni v Sloveniji trenutno temelji na klasični mikrobiološki metodi z izolacijo povzročitelja na gojiščih, ki spodbujajo kalitev spor in rast P. larvae. Determinacija P. larvae se klasično izvaja na podlagi značilnih morfoloških in biokemijskih lastnosti povzročitelja. V zadnjem času pa smo ob klasični diagnostiki na osnovi biokemijskih lastnosti, ki je lahko precej zamudna (za P. larvae traja 4–10 dni), tudi v Sloveniji začeli vpeljevati metodo določanja bakterijskih povzročiteljev na osnovi masne spektrometrije z aparaturo MALDI-TOF.

Za genotipizacijo pridobljenih izolatov P. larvae je najbolj uveljavljena genotipizacijska metoda ERIC-PCR, ki temelji na pomnoževanju ponavljajočih se ohranjenih genskih zaporedij. Opisani so štirje genotipi P. larvae (ERIC I–IV), v kliničnih primerih pa se pojavljata samo genotipa ERIC I in II. Med seboj se razlikujeta tudi fenotipsko, predvsem po morfologiji bakterijskih kolonij in spor ter po biokemijskih lastnostih. Najpomembnejša pa je razlika v virulenci. Sevi genotipa ERIC I so bolj virulentni na ravni čebelje družine, sevi genotipa ERIC II pa so bolj virulentni na ravni posamezne čebelje ličinke. Določitev tipa ERIC ima tako uporabno vrednost predvsem pri napovedi poteka bolezni v čebelnjaku.

Vse izolate P. larvae, ki jih bomo pridobili v okviru projekta, bomo tipizirali z metodo ERIC-PCR in s tem določili prevalenco tipov ERIC v Sloveniji, ki do danes še ni poznana. Ugotavljali bomo povezavo tipov ERIC s pripadajočo klinično sliko in preučili smotrnost spremembe smernic za zamejitev bolezni v povezavi s pripadajočim tipom ERIC. Vpeljava metode ERIC bo omogočila tudi ugotavljanje genotipa ERIC pri prospektivnem spremljanju izbruhov hude gnilobe.

Pred nekaj leti je bila razvita tudi shema za določanje genotipov P. larvae na osnovi zaporedij sedmih genskih lokusov, t.i. MLST (ang. multilocus sequence typing) tipizacija. Za epizootiološko spremljanje bolezni je zaradi večje moči razlikovanja v primerjavi z metodo ERIC-PCR primernejša metoda MLST, daleč najboljša pa je metoda WGS (sekvenciranje celotnih genomov, ang. whole-genome sequencing) z največjo močjo razlikovanja. Prvi izmed najbolj pogostih principov pridobivanja informacij iz podatkov WGS, relevantnih za tipizacijo, je analiza zaporedij zelo velikega števila genskih lokusov znotraj definirane sheme MLST, ki zajema večji (wgMLST, ang. whole genome MLST) ali manjši (cgMLST, ang. core genome MLST) del bakterijskega genoma. Drugi izmed najbolj pogostih pristopov analize podatkov WGS pa je analiza SNP (ang. single nucleotide polymorphism), t.j. analiza nukleotidnih polimorfizmov znotraj celotnega bakterijskega genoma, ki omogoča najbolj verodostojno rekonstrukcijo sorodstvenih odnosov med proučevanimi izolati. Metoda WGS je trenutno ultimativna metoda izbora za tipizacijo bakterij.

Izbranim izolatom, ki so domnevno epidemiološko povezani, bomo določili zaporedja celotnih genomov z metodo WGS. S primerjavo genomskih zaporedij izolatov P. larvae bomo dobili vpogled v genetsko raznolikost epidemiološko povezanih izolatov in podrobneje opredelili izbruhe bolezni. Izolatom bomo določili tudi pripadajoči sekvenčni tip po klasični shemi MLST sedmih genov, kar nam bo omogočilo opredelitev populacijske strukture izolatov P. larvae v Sloveniji in jih umestiti v svetovni okvir.

V okviru projekta bomo vpeljali tudi molekularno kvantifikacijo bakterije P. larvae v vzorcih medu z metodo PCR (ang. polymerase chain reaction). Za ta namen bomo uporabili metodi qPCR (PCR v realnem času) in dPCR (digitalni PCR). Glavna prednost metode dPCR je zmožnost absolutne kvantifikacije, ki nam bo omogočila, da bomo metodo qPCR umerili glede na rezultate dPCR brez potrebe po štetju bakterij z gojiščno metodo, ki je v primeru spor dokaj nezanesljiva. Na osnovi rezultatov bomo opredelili napovedno vrednost števila spor v medu za potencialni pojav kliničnih znakov AFB.

Na osnovi vseh pridobljenih rezultatov bomo v okviru projekta opredelili smotrnost trenutno veljavnih smernic za nadzor bolezni, vključno z velikostjo kužnega kroga. Pričakujemo, da bodo izsledki projekta izboljšali naše poznavanje bolezni z epizootiološkega vidika, vključno z boljšim poznavanjem poti širjenja povzročitelja bolezni in vplivom oddaljenosti od žarišča bolezni do morebitne nove okužbe čebeljih družin. Če bomo z raziskavo ugotovili, da pojavi hude gnilobe znotraj trikilometrskega pasu ne izvirajo iz istega žarišča, bodo naše ugotovitve predstavljale osnovo za spremembo pravilnika, na podlagi česar bi lahko zmanjšali velikost pasu, znotraj katerega velja prepoved premikov čebel. S tem bi lahko zmanjšali ekonomsko škodo čebelarjev zaradi prepovedi prevozov čebel na pašo ter trgovine s čebelami in maticami. Z vsemi ugotovitvami bomo seznanili čebelarsko javnost neposredno na izobraževanjih čebelarjev ter z objavami v strokovnem tisku. Temeljne in izvirne znanstvene izsledke, pridobljene v okviru projekta, bomo objavili v znanstvenih revijah in predstavili na strokovnih ali znanstvenih srečanjih. Delo na projektu bo predstavljalo pomemben doprinos k mednarodni izmenjavi znanja in promociji znanosti v Sloveniji. Nova spoznanja bomo vključili tudi v pedagoško in raziskovalno delo na Veterinarski fakulteti Univerze v Ljubljani.

SICRIS