Splošni podatki

Faze projekta

Vsebinski opis projekta

Bakterija Paenibacillus larvae je povzročitelj hude gnilobe čebelje zalege (AFB). Gre za najpomembnejšo bakterijsko bolezen čebel, ki povzroča velike izgube v čebelarski industriji. Zaradi izrednega pomena čebel kot opraševalcev ima AFB tudi širši ekološki pomen. Epidemiološko spremljanje bakterije P. larvae je nujen del priprave in izvajanja uspešnih programov za nadzor in preprečevanje AFB. V zadnjih 15 letih je to temeljilo na pomnoževanju zaporedij ERIC z verižno reakcijo s polimerazo (PCR), ki bakterijo P. larvae razvršča v pet tipov. Epidemiološko najpomembnejša tipa ERIC I in ERIC II se med seboj razlikujeta v virulenci; tip ERIC I je bolj virulenten na ravni čebelje družine, tip ERIC II pa je bolj virulenten na ravni ličink. ERIC-tipizacija ima omejeno moč razlikovanja in zato ni primerna za ugotavljanje poti širjenja bolezni ali opredelitev izbruhov. Nekoliko večjo moč razlikovanja ima tipizacija na osnovi zaporedij več lokusov (MLST), ki bakterijo P. larvae razvršča v sekvenčne tipe (ST); trenutno jih je znanih 30. Velik napredek na področju tipizacije mikroorganizmov predstavlja sekvenciranje celotnih genomov (WGS), ki ima veliko večjo moč razlikovanja in omogoča vpogled v celoten nabor genov preučevanega izolata, vključno z determinantami virulence in odpornosti proti protimikrobnim učinkovinam. 

Večje število spor P. larvae v čebeljih vzorcih, zlasti v vzorcih drobirja in čebel negovalk, je povezano z večjo verjetnostjo za pojav AFB oz. slabšim sanitarnim statusom čebelje družine, zato so potrebne zanesljive metode za kvantifikacijo spor v tovrstnih vzorcih. Zgodnje odkrivanje čebeljih družin z večjim tveganjem za pojav AFB bi pomenilo velik napredek pri preprečevanju širjenja AFB. Klasično štetje spor na bakterioloških gojiščih zaradi slabe in nekonsistentne kalitve spor P. larvae ni zanesljivo. V okviru ciljnega raziskovalnega projekta V4-1804 smo vpeljali zanesljivo molekularno kvantifikacijo bakterije P. larvae v vzorcih medu in drobirja s kvantitativnim PCR v realnem času (qPCR), ki smo jo kalibrirali z digitalnim PCR (dPCR), s čimer smo premostili omejitve števne gojiščne preiskave. 

V prvem sklopu predlaganega projekta bomo metodo qPCR validirali in kalibrirali tudi za vzorce čebel negovalk, nato pa v teh vzorcih in vzorcih drobirja z metodo qPCR kvantificirali spore P. larvae. Vzorci bodo izvirali iz čebeljih družin z znanim in različnim kliničnim statusom AFB. Opredelili bomo povezavo med številom spor v drobirju in pri čebelah negovalkah ter klinično sliko pripadajoče družine, s tem pa ugotovili družine z večjim tveganjem za pojav AFB. V drugem sklopu bomo čebelje ličinke izpostavili različnim sevom P. larvae izbranega tipa ERIC. S tem bomo dobili vpogled v virulenco različnih sevov P. larvae znotraj izbranega tipa ERIC (ne le tipskih sevov tipa ERIC I in II), ki je do danes slabo poznana, vključno z virulenco sekvenčnega tipa ST30 in izolatov z dvema novima različicama profila ERIC I, ki smo jih pred kratkim novo odkrili med izolati P. larvae iz Slovenije. V tretjem sklopu bomo z metodo WGS opredelili genetske značilnosti retrospektivno in prospektivno pridobljenih izolatov P. larvae, vključno s plazmidi, determinantami virulence in odpornosti ter gručami genov za sintezo sekundarnih metabolitov. S tem bomo izboljšali razumevanje genetske raznolikosti in evolucije bakterije P. larvae ter ugotavljali morebitne povezave klinično relevantnih genetskih determinant s tipi ERIC, MLST in wgMLST. Zbrani rezultati o povezavi med številom spor v čebeljih vzorcih in klinično sliko pripadajoče družine, virulenci izbranih sevov P. larvae in genetskem potencialu bakterije P. larvae bodo predstavljali pomemben doprinos k epidemiološkemu nadzoru AFB v svetovnem merilu.

Sestava projekte skupine