Splošni podatki

Faze projekta

DS1: Izbor in optimizacija markerjev za sledenje virom kontaminacije okolja z izločki ptic, perutnine in prašičev. 

Namen DS1 je preizkusiti in identificirati najbolj primerne markerje za sledenje virom kontaminacije okolja z izločki domačih in divjih prašičev, ptic na splošno, domače perutnine in vodnih ptic. Rezultate bomo uporabili v nadaljevanju študije, kjer bomo določili najbolj primerne okoljske točke za vzorčenje in testiranje na izbrane patogene mikroorganizme na farmah (DS3) in za epidemiologijo patogenih mikroorganizmov pri prostoživečih živalih v okoljskih vzorcih (DS4) ter detekcijo markerjev v odpadnih vodah (DS2).

DS2: Izbor in optimizacija metod za diagnostiko AIV in virusa APK v odpadnih vodah s sledenjem vira kontaminacije 

Cilj DS2 je oceniti, ali je strategija epidemiologije na podlagi odpadnih voda uporabna za spremljanje pojavov influence in afriške prašičje kuge. Osnova bo že preverjena metodologija za spremljanje SARS-CoV-2 v odpadnih vodah, katero bomo preverili in validirali za virus APK in AI. Validiran protokol bomo uporabili na vzorcih odpadne vode iz čistilne naprave (ČN).

DS3: Izbor in optimizacija metod za diagnostiko virusov AI in APK v okoljskih vzorcih na farmah (nastilj, gnojevka) s sledenjem viru kontaminacije.

Namen DS3 je izbrati in vpeljati metode vzorčenja, ekstrakcije in detekcije nukleinskih kislin virusov AIV v nastilju in APK v gnojevki ter sledenje gostiteljev z uporabo molekularnih markerjev, izbranih v okviru DS1. Rezultati bodo pripomogli k vzpostavitvi dodatnega sistema za ugotavljanje patogenih mikroorganizmov, kot sta APK in AIV, v stranskih produktih domačih živali, ki se jih vnaša v okolje kot gnojilo, in s tem pravočasno preprečevanje širjenja virusov v okolje.

DS4: Detekcija virusov AI in APK pri prostoživečih živalih v okoljskih vzorcih (zemlja, blato/sediment, voda) s sledenjem viru kontaminacije

Namen DS4 je izbrati in vpeljati metode vzorčenja, izolacije in detekcije nukleinskih kislin virusov AI in APK v različnih matriksih, kot so zemlja, blato in vode iz kaluže, ter sledenje potencialnih gostiteljev z uporabo molekularnih markerjev, izbranih v okviru DS1. Na izbranih lokacijah bomo izvedli pilotno študijo monitoringa. DS4 bo razdeljen na 4 naloge. Rezultati bodo pripomogli k vzpostavitvi sistema za neinvazivno ugotavljanje patogenih mikroorganizmov v okoljskih vzorcih v različnih habitatih in sledenje gostiteljskim vrstam živali na preiskovanih lokacijah.

DS5: Viabilty PCR z reverzno transkripcijo 

Namen DS5 je načrtovanje, testiranje in validacija v-RT PCR v realnem času za dokazovanje AIV, v okviru katerega bomo preizkusili in ocenili učinkovitost predhodne obdelave testnih vzorcev z EMA in PMA; s posledičnim preprečevanjem pomnoževanja nukleinske kisline virionov AIV, ki v določenih tipih testnih vzorcev niso sposobni preživetja, bomo poskušali natančno okarakterizirati postopek kvantifikacije števila živih/infektivnih virionov AIV. Ker so Graiver in sod. (2010) opisali, da EMA ne zavira pomnoževanja RNA neživih AIV z RT PCR, se bomo v naših raziskavah osredotočili na v-RT PCR v realnem času z uporabo PMA. Rezultati bodo pripomogli k dodatni karakterizaciji (1) znanstvene interpretacije ter (2) praktičnih omejitev dokazovanja prisotnosti živih virionov AIV v okoljskih vzorcih z v-RT PCR v realnem času. Preko opredelitve možnih težav, pristranskosti in nejasnosti v-RT PCR v realnem času bomo predlagali nadaljnje, dodatne in alternativne postopke izboljšav dokazovanja prisotnosti živih/infektivnih virionov AIV v okoljskih vzorcih .

Vsebinski opis projekta

Iztrebki in drugi izločki živali, zlasti perutnine, ptic in prašičev, so lahko rezervoar različnih patogenov nevarnih za zdravje ljudi in živali, med katere uvrščamo zelo aktualni in posebno nevarni virusni bolezni; aviarna influenca (AI), s povzročitelji katere se v zadnjih letih vse pogosteje okužujejo tudi sesalci, in afriška prašičja kuga (APK). Ptice, zlasti vodne, lahko z izločki kontaminirajo z virusi AI jezera in reke ter zemljo obalnega pasu prej omenjenih vodnih površin. Divji prašiči lahko prek telesnih izločkov z virusom APK kontaminirajo stoječe in tekoče vode, zemljo ter poljščine. Preko tovrstne kontaminacije okolja, predstavlja okolje samo, kot tudi krma in pitna voda iz kontaminiranega okolja, vir okužbe tako za prostoživeče kot rejne živali in v primeru aviarne influence, potencialno tudi za ljudi. 

Glede na velik epidemiološki potencial, ki ga imajo izločki perutnine, ptic in prašičev, je pomembno ugotoviti vir in stopnjo kontaminacije okolja. V projektu bomo vpeljali in validirali metode sledenja mikrobnim virom za ugotavljanje kontaminacije okolja z izločki ptic, perutnine in prašičev. Validirane metode nam bodo omogočale sledenje prisotnosti tarčnih vrst živali - prašiči, divji prašiči, perutnina in ptice v okolju in primernosti preiskovanih matriksov - odpadne vode, gnojevka, nastilj zemlja in stoječe vode za detekcijo tarčnih patogenov, natančneje virusov APK in AI. 

Za monitoring so najbolj primerne točke s konstantno visoko koncentracijo markerja, katere bomo določili v projektu in jih v nadaljevanju uporabili za izvedbo monitoringa. Glede na trenutne epidemiološke podatke pričakujemo, da bomo viruse influence ugotavljali v odpadnih vodah, saj je algoritem detekcije tak, da v prvem koraku ugotavljamo prisotnost virusov influence A, torej viruse aviarnega, prašičjega in humanega izvora, v naslednjem koraku pa specifične visoko patogene viruse AI. 

Glede na to, da so vodne ptice vektor za viruse AI, pričakujemo, da bomo te viruse detektirali v vzorcih zemlje iz obrežnega pasu. Reje perutnine so v Sloveniji trenutno proste virusa AI, ravno tako nismo še potrdili virusa APK pri divjih ali domačih prašičih, tako da SLO pričakujemo, vsaj v primeru, da bodo epidemiološke razmere tekom projekta ostale podobne zdajšnjim, negativne rezultate spremljanja prisotnosti virusov v gnojevki nastilju in zemlji ter vodi kontaminirani s fekalnim markerji divjih prašičev.

Eno od glavnih/kritičnih ovir za uporabo PCR kot metode kvantitativnega določanja virusnih patogenov pa predstavlja razlikovanje med živimi in neživimi virioni. Ločevanje med samo detekcijo virusa in zmožnostjo detektiranega virusa za nadaljnje okužbe, je lahko velikega pomena pri oceni situacije in načrtovanju ukrepov za zajezitev širjenja okužb. Tako je eden od ciljev projekta tudi načrtovanje, testiranje in validacija v-RT PCR v realnem času za dokazovanje AIV s katero bi želeli natančno kvantificirati število živih/infektivnih virionov. Rezultati projekta bodo zaradi njihove epidemiološke pomembnosti redno posredovani Upravi za varno hrano, veterino in varstvo rastlin (UVHVVR).Tako bo pristojni organ za nadzor nad afriško prašičjo kugo in aviarno influenco (UVHVVR) lahko v realnem času spremljal rezultate dodatnega monitoringa okolja na prej omenjeni bolezni, ki je del predlaganega projekta in jih smiselno dopolnjeval z rezultati konvencionalnega monitoringa na ti dve bolezni, ki se izvaja letno. Zasnova prijavljenega projekta je pripravljena tako, da je projektno delo v celoti prenosljivo v prakso in bi lahko v praksi predstavljajo dodatni monitoring pojava posebno nevarnih kužnih bolezni živali in zoonoz.

Sestava projekte skupine

https://cris.cobiss.net/ecris/si/sl/project/22222