NRL za steklino


Nacionalni referenčni laboratorij za steklino (NRL za steklino)

Vodja NRL

peter_hostnikProf. dr. Peter Hostnik, dr. vet. med.

Kontakt: Telefon: +386 01 47 79 178, mobitel: 00366 40 398 310

e-mail: peter.hostnik@vf.uni-lj.si

 

 

 

 

Ime centralnega referenčnega laboratorija EU

ANSES – EU-RL for rabies

Laboratoire de la rage et de la faune sauvage de Nancy

Technopole Agricole et Vétérinaire – Bâtiment H
CS 40009
F-54220 MALZEVILLE
FRANCE
Phone: +33 (0)3 83 29 89 50
Fax: +33(0)3 83 29 89 58

 

Poslanstvo NRL za steklino

NRL za steklino je edini imenovani in pooblaščeni laboratorij za izvajanje diagnostike in spremljanja uspešnosti oralne vakcinacije lisic, izvajanje serološke diagnostike preverjanja uspešnosti cepljenja psov za potrebe mednarodnega prometa v Sloveniji, ki deluje v okviru Virološkega laboratorija pri Inštitutu za mikrobiologijo in parazitologijo Veterinarske fakultete.

Poslanstvo NRL za steklino je izvajanje diagnostike stekline, razvijanje in uvajanje novih ter vzdrževanje že akreditiranih diagnostičnih metod, spremljanje pojavnosti stekline doma in v svetu, sodelovanje pri izvajanju programa stekline v Sloveniji, izvajanje laboratorijskega nadzora uspešnosti cepljenja lisic, ugotavljanje titra protiteles pri hišnih živalih v mednarodnem prometu in izdajanje ustreznih poročil, informiranje in sodelovanje z humano epidemiološko službo pri preprečevanju okužb ljudi ter nudenje informacij o steklini strokovni in širši javnosti.

EU-RL za steklino vsako leto preveri kakovost dela v našem NRL-ju v obliki medlaboratorijskih kontrol. O rezultatih preverjanja je obveščena tudi EU komisija in UVHVVR v Ljubljni. V primeru, da so rezultati preverjanja negativni ima NRL eno možnost popravnega izpita sicer pa izgubi status in s tem mednarodno veljavnost izvidov.

 

Kratek opis bolezni s klinično sliko

Steklina je virusne bolezen sesalcev, pa tudi človeka, ki se kaže v obliki encefalomielitisov. Virus, ki povzroča to obolenje je uvrščen v družino Rhabdoviridae, rod Lyssavirus. Poznanih je 14 vrst virusov. Najbolj je razširjena je vrsta 1. Virus se prenaša iz okužene živali na zdravo s kontaktom, najpogosteje z ugrizom, ali z vnosom infekta na poškodovano kožo ali sluznice. Na mestu vnosa se lahko virus razmnožuje tudi v tkivih, ki niso živčnega izvora, v celicah miščnine. Iz mesta vnosa se virus transportira do centralnega živčnega sistema po živčevju, se v centralnem živčnem sistemu namnoži in nato potuje po živčevju periferno v mnoga tkiva kot so skeletna muskulatura, ledvica, korneo , slinsko žlezo in druge. Za življenjski krog virusa je pomembno zlasti njegovo razmnoževanje v slinski žlezi. V Evropi se virus ohranja zlasti znotraj populacije lisic, v nekaterih državah Azije in Afrike pa so psi še vedno pomemben rezervoar in vektor stekline tako na druge živali kot človeka. Pomemben vektor so tudi krvosesni netipirji, netopirske vrste virusa stekline pa so prisotne tudi v kolonijah insektojedih netopirjev. V Sloveniji še niso bile ugotovljene.

Dolžina obdobja od vnosa virusa v organizem pa do pojava kliničnih znamenj bolezni je odvisna od doze virusa, vrste živali in mesta okužbe. Za mačke velja, da inkubacijska doba traja od 4 do 6 tednov, za pse pa od 4 tednov pa tudi do več mesecev. Za prenos bolezni je ključnega pomena prisotnost virusa v slini bolne živali, ki pa se pojavi lahko celo 14 dni pred pojavom kliničnih znamenj bolezni. V prvi fazi obolenja zaznamo spremenjeno obnašanje živali. Žival postane hiperaktivna, hipersenzitivna zlasti na svetlobo in zvok. Pojavi se povišana telesna temperatura, dilatacija očesnih zenic in prekomerno slinjenje živali. V času furioznega stanja je žival neposlušna, brezglavo teka, je napadalna. Po tej fazi se pojavi paraliza, najprej žvekalnih mišic, paraliza okončin, nato še dihalnih mišic temu pa sledi pogin.

Virusi stekline je občutljiv za vsa lipidna topila, detergente, formalin, beta-propiolakton, amonijeve ione, eter in druga razkužila. Občutljiv je na višjo temperature, UV svetlobo in je stabilen v območju pH od 5,5 do 8. Ob prisotnosti organskega materiala, v hladnem in vlažnem okolju pa lahko virus preživi več časa.

 

Sum na steklino, vrsta vzorcev, ki jih je potrebno odvzeti

Na steklino posumimo v primeru pojava značilnih kliničnih znamenj značilnih za steklino, v našem okolju je zlasti, če se divje živali nenavadno obnašajo, niso plašne, so napadalne, se zatečejo v naselja, se spopadajo s psi

  • poginjene ali usmrčene živali (možgani)

  • vzorec sline, kornealni bris – bolna, sumljiva žival

  • kontrola uspešnosti cepljenja psov, mačk, dihurjev: vzorec krvi brez antikoagulanta

  • Kontrola uspešnosti cepljenja lisic: kri, torakalan tekočina

  • Biomarker, starost: spodnja čeljust

  • Kontrola cepiva: 10 vab

 

Pošiljanje vzorcev v laboratorij

  • kadavre je potrebno poslati preko veterinarsko higienske službe ali jih v vodotesni embalaži dostaviti veterinarski ambulanti (lovci)

  • Vzorce odvzame patolog

  • Odvzem vzorcev bolni živali opravi veterinary praktik

  • Vzorci in kadavri morajo biti opremljeni z dopisom, ki vsebuje podatke o vzorcu, vrsti živali, anamnezi, času odvzema vzorca, lokaciji, kje se je žival nahajala, naslovu lastnika, pošiljatelja ter plačnika (oz. EPI zapisnik).

  • Vzorci se morajo od odvzema do prevzema v laboratorij hraniti pri temperaturi cca +4°.>

  • trupla odpelje VHS služba

  • cepivo dostavi Veterinarska inšpekcija

 

Ker gre za zelo nevarno in kužno bolezen, je potrebno vzorce in kadavre zlasti v primeru, ko gre za poškodbo človeka iz strani sumljive živali dostaviti v laboratorij oz. znotraj 24-tih ur od prevzema.

 

Laboratorijske metode, ki jih izvajamo na NRL

A. Direktno dokazovanje pristnosti virusa

 

Direktni imunofluorescenčni test

Metoda omogoča hitro dokazovanje virusnih proteinov v okuženih celicah sumljivih živali. Primeren vzorec je možgansko tkivo, zlasti Amonov rog. Na predmetno stekelce pripravimo odtisek tkiva, ga fiksiramo in inkubiramo z imunofluorescenčnim konjugatom, ki vsebuje specifična protitelesa proti N protein virusa stekline. Rezultate čitamo pod fluorescenčnim mikroskopom. V primeru, da je v celicah preiskovanega tkiva prisoten virus stekline se ta mesta obarvajo zeleno. Konjugat je specifičen za vse vrste virusov iz rodu Lyssavirus. Rezultat dobimo v treh urah.

 

Dokaz virusne RNK-a z molekularnimi metodami

Molekularne metode nam omogočajo hitro in zanesljivo detekcijo virusne RNK-a direktno iz vzorca ali po izolaciji virusa na kokošjih embriih. Metoda temelji na encimski reakciji tako imenovanem obratnem prepisovanju (RT) in verižni reakciji s polimerazo (PCR), kjer virusno RNK-a prepišemo v DNK-a in nato pomnožimo specifičen odsek genoma. Rezultate lahko dobimo že v nekaj urah. Z molekularnimi metodami lahko uhotavljamo tudi razlike med posameznimi virusu, jih lahko tipiziramo in divje seve virusov lahko razlikujemo od sevov, ki se uporabljajo za cepiva. Prednost teh metod je velika njihova občutljivost in specifičnost. pilnem mestu gena za hemaglutinin.Z določanjem nukleotidnih zaporedji celih genov oz. virusnih genomov proučujemo spreminjanje virusov in pridobivamo podatke za izdelavo epidemioloških študij.

 

Izolacija virusa na celičnih kulturah

Za izolacijo virusa stekline uporabljamo celično kulturo NA (Neuroblastoma celice mišjega izvora). S to metodo namnožimo virus, in ga dokažemo v celicah NA, kar je nujno potrebno izvesti v primeru ugriza človeka iz starni sumljive živali, ki je bila potem pokončana. Izolati so potrebni tudi za kvalitetno določanje nukleotidnega zaporedja celemu virusnemu genomu oz. posameznim genom.

 

B. Serološke metode 

 

Test FAVN

Test FAVN (fluorescent antibody virus neutralisation test) je predpisana metoda za določanje protiteles proti virusu stekline po cepljenju. Psi, mačke in beli dihurji, ki potujejo v nekatere države izven EU (npr. Srbija, Bosna in Hercegovina, Avstralija…) potrebujejo tudi potrdilo o uspešnosti cepljenja proti steklini – titer protiteles. Test FAVN temelji na principu nevtralizacije virusa s sprotitelesi, ki so prisotna v serumu cepljenih psov. Rezultat je izražen v internacionalnih enotah (IU/ml). Žival s katero potujemo mara imeti titer nad 0.5 IU/ml. Izvedba testa traja tri dni.

 

C. Kontrola uspešnosti oralne vakcinacije lisic

Za potrebe kvantifikacije cepljenja lisic proti stekliniizvajamo naslednje alboratorijske metode:

 

Določanje količine virusa v cepivu

Vsako serijo cepiva Fuchsoral, ki jo UVHVVR uporabi v programu izkoreninjanja stekline preverimo na prisotnost in količino virusa stekline v enem mililitru cepiva.Metodo izvajamo v mikrotitrskih ploščicah. Pripravimo destkratne razredčine cepnega virusa. Posamezne razredčine v 6 ponovitvah vnesemo v jamice mikroplošč, dodamo suspenzijo celične kulture NA in inkubioramo 48 ur. Z imunofluorescenčnim testom določamo v kateri razredčini se je virus še pomnoževal in na osnovi tega izračunamo končni titer virusa izražen v PFU enotah (Plag Forming Units).

 

Test ELISA

V krvi in telesnih tekočinah lisic, ki so uplenjene na področju vakcinacije določamo prisotnost protiteles prit virusu stekline. Uporabljamo komercialno dosegljiv ELISA kit – BioPro. Rezultate čitamo s fotometrom in jih glede na vrednosti kontrolnih vzorcev ovrednotimo. Odstotek lisic, ki imajo protitelesa proti virusu steklien nam kaže na uspešnost cepljenja in posredno na kakovost in optimizacijo polaganja vab.

 

Določanje biomarkerja

Samo cepivo vsebuje tudi tetraciklin, ki ima vlogo biomarkerja. Lisica, ki zaužije vabo se ji tetraciklin v nekaj dneh že naloži v kostnino in zobni cement. V ta namen se uplenjeni lisici izdre podočnik, v laboratoriju pa se iz zobnega apeksa pripravi rezina debeline do 0.2 mm. Pri pregledu zobne rezine pod fluorescenčnim mikroskopom so mesta naloženega biomarkerja dobro vidna. Število lisic z biomarkerjem so odličen pokazatelj uspešnosti izvedbe cepljenja. Po standard, mora vsaj 70% populacije lisic biti pozitivnih na biomarker.

 

Določanje starosti lisic

V isti rezini, ki se uporabi za določanje biomarkerja lahko tudi ocenimo starost lisice. Ker je v zimskih mesecih, zaradi pomanjkanja hrane nalaganje cementa počasnejše je to vidno na sami rezini v obliki gostejših in redkejših plasti zobnega cementa. Glede na čas uplenitve lisice in glede na dejstvo, da se lisice v Sloveniji kotijo v marcu in maju lahko dokaj natančno določimo ali gre za starejšo žival ali lisico mlajšo od enega leta. Pri interpretaciji uspešnosti cepljenja je potrebno upoštevati tudi starost lisic, saj večina mladih lisic rojenih spomladi ne pride v stik s cepivom, ki se polaga v maju. V poletnem obdobju, vse do jesenske akcije je tako precejšnja populacija mladih lisic necepljenih.

 

Zakonodaja

 

Povezave