NRL za aviarno influenco (AI)


Nacionalni referenčni laboratorij za aviarno influenco (NRL za AI)

 Vodja NRL

Asist. dr. Brigita Slavec, dr. vet. med.

Kontakt:

Telefon: +386 01 47 79 240

e-mail: brigita.slavec@vf.uni-lj.si

 

Ime centralnega referenčnega laboratorija EU

EU-RL for Avian Influenza

Central Veterinary Laboratory,

New Haw, Weybridge,

Surry KT 15 3NB,

United Kingdom

 

Poslanstvo NRL za AI

NRL za AI je edini imenovani in pooblaščeni laboratorij za izvajanje diagnostike aviarne influence v Sloveniji, ki deluje v okviru Laboratorija za diagnostiko kužnih bolezni perutnine Nacionalnega veterinarskega inštituta in Inštituta za zdravstveno varstvo perutnine Veterinarske fakultete.

Poslanstvo NRL za AI je izvajanje diagnostike AI, razvijanje in uvajanje novih ter vzdrževanje že akreditiranih diagnostičnih metod, spremljanje pojavnosti AI v svetu, zagotavljanje pripravljenosti za primer izbruha bolezni ter nudenje informacij o AI strokovni in širši javnosti.

 

Kratek opis bolezni s klinično sliko

Aviarno influenco, imenovano tudi kokošja kuga ali ptičja gripa, povzročajo virusi influence tipa A. Prostoživeče ptice veljajo za rezervoar virusov AI. To so virusi RNK, ki spadajo v družino Orthomyxoviridae in lahko okužijo ptice in sesalce, vključno z ljudmi. Izbruhi aviarne influence se pojavljajo po celem svetu. Glede na antigenske značilnosti površinskih proteinov hemaglutinina (HA) in neuraminidaze (N) jih razvrščamo 17 HA in 9 N podtipov, ki se lahko poljubno kombinirajo. Ti virusi so podvrženi hitremu spreminjanju svojih patogenih lastnosti. Generalno jih razdelimo, glede na klinično sliko pri perutnini, v nizko patogene seve (LPAI), ki običajno povzročajo blažje klinične znake ali okužba poteka celo subklinično in visoko patogene seve (HPAI), ki povzročijo resno klinično sliko z visokim poginom.

Virusi AI so občutljivi za vsa lipidna topila, detergente, formalin, beta-propiolakton, amonijeve ione, eter in druga razkužila. Občutljivi so na višjo temperaturo in stabilni v območju pH od 5,5 do 8. Ob prisotnosti organskega materiala, v hladnem in vlažnem okolju pa lahko virus preživi več časa. V vlažnih iztrebkih pri 4ͦ C virus preživi od 30 do 35 dni, pri 20ͦ C pa sedem dni. V vodi preživi do 30 dni pri 28ͦ C oz. do 158 dni pri 17°.

Klinična slika

A: Visoko patogeni sevi AI (HPAI) (podtipi H5 in H7):
  • ni posebnih patognomičnih kliničnih znakov
  • prvi klinični znaki se lahko pojavijo v nekaj urah po okužbi oziroma v 14 dneh
  • pri perutnini je pogost nenaden visok pogin (do 100 %)

Če se klinični znaki pojavijo, so najpogostejši:

  • ataksija, tremor glave in vratu, tortikolis, živali težko hodijo, se manj oglašajo
  • depresija, neješčnost, živali manj pijejo
  • drastičen padec nesnosti (slabša kvaliteta jajc
  • kašljanje, smrkanje, oteženo dihanje, otekli sinusi, izcedek iz nosnic in oči
  • cianoza kože glave in nog
  • driska
  • pri nekaterih vodni pticah so lahko vidni le blažji simptomi
B. Nizko patogeni sevi AI (LPAI)(podtipi H5, H7, H9, lahko tudi drugi):
  • klinični znaki niso tako dramatični kot pri HPAI
  • padec nesnosti
  • respiratorni znaki: kašljanje, smrkanje, oteženo dihanje, otekli sinusi, izcedek iz nosnic in oči
  • slabša ješčnost in poraba vode
  • našopirjenost, depresija
  • cianoza kože glave in nog
  • driska
  • pogin je običajno do 20 %.

Okužba se dokaže z laboratorijsko potrditvijo virusa.

 

Vrsta vzorcev, ki jih je potrebno odvzeti

  • poginjene ali živali s kliničnimi znaki (če je mogoče vsaj 5 živali)
  • orofaringealni in kloakalni brisi (20 kloakalnih in 20 orofaringealnih brisov, če je živali manj, se odvzame vzorce vsem živalim prisotnim na gospodarstvu). Za odvzem se uporabi suhe sterilne vatenke, ki jih po odvzemu damo v sterilno epruveto ali vatenke z ustreznim medijem namenjenim virološkim preiskavam.
  • svež feces 20. živali (če ni mogoče dobiti drugih vzorcev)
  • krvni vzorci iz katerih pridobimo serum (20 vzorcev krvi oz. če je živali manj se odvzame vzorce vsem živalim prisotnim na gospodarstvu)

 

Pošiljanje vzorcev v laboratorij

  • Vzorce je potrebno poslati v laboratorij v troslojni embalaži.
  • Vzorce se nepredušno zapre v ustrezno sterilno, vodotesno embalažo in se jih označi, tako da je razvidna identifikacija vzorca. Več tako pripravljenih vzorcev se da v večjo nepredušno zaprto vrečko, v kateri je vpojni papir, njeno zunanjost pa
  • Vzorci morajo biti opremljeni z dopisom, ki vsebuje podatke o vzorcu, vrsti živali, anamnezi, času odvzema vzorca, lokaciji, kje se je žival nahajala, naslovu lastnika, pošiljatelja ter plačnika (oz. EPI zapisnik).
  • Vzorci se morajo od odvzema do prevzema v laboratorij hraniti pri temperaturi cca +4°.>
  • trupla odpelje VHS služba

Ker gre za zelo nevarno in kužno bolezen, je potrebno vzorce čimprej dostaviti v laboratorij oz. znotraj 24-tih ur od odvzema.

 

Laboratorijske metode, ki jih izvajamo na NRL

A.Direktno dokazovanje virusa
Dokaz virusne RNK-a z molekularnimi metodami

Molekularne metode nam omogočajo hitro in zanesljivo detekcijo virusne RNK-a direktno iz vzorca ali po izolaciji virusa na kokošjih embriih. Metoda temelji na encimski reakciji tako imenovanem obratnem prepisovanju (RT) in verižni reakciji s polimerazo (PCR), kjer virusno RNK-a prepišemo v DNK-a in nato pomnožimo specifičen odsek genoma. Rezultate lahko dobimo že v nekaj urah.

Z molekularnimi metodami ugotavljamo podtip influence A in posamezne podtipe AI pri pticah in sesalcih. Pri podtipu H5 in H7 pa na osnovi nukleotidnega zaporedja določamo patotip virusa.

Prednost teh metod je, da lahko hitro in brez bioloških poizkusov na živalih (določanje intravenoznega indeksa patogenosti) določimo patogenost virusa z določitvijo nukleotidnega zaporedja na cepilnem mestu gena za hemaglutinin.

Z določanjem nukleotidnih zaporedji celih genov oz. virusnih genomov proučujemo spreminjanje virusov in pridobivamo podatke za izdelavo epidemioloških študij.

 

Izolacija virusa na kokošjih embriih

Izolacija virusa na kokošjih embriih je kljub molekularni diagnostiki še vedno zlati standard. Za izolacijo virusa uporabljamo embrionirana jajca kokoši prostih specifičnih patogenov. S to metodo namnožimo virus, kar je nujno za izvedbo biološkega poskusa na piščancih za ugotavljanje patogenosti, ki ga izvaja EU RL. Izolati so potrebni tudi za kvalitetno določanje nukleotidnega zaporedja celemu virusnemu genomu oz. posameznim genom.

 

Test hemaglutinacije

Test temelji na sposobnosti virusa AI, da se veže na eritrocite in prepreči njihovo sedimentacijo. S to metodo lahko hitro ugotovimo ali se je virus na kokošjih embriih namnožil in v kakšnem titru. Za določitev podtipa se uporabi test inhibicije hemaglutinacije, kjer se uporabi specifična protitelesa za posamezne podtipe.

 

B. Indirektno dokazovanje virusa
Test inhibicije hemaglutinacije

Metoda temelji na reakciji med hemaglutinacijsko aktivnimi virusi in antiserumom, ki vsebuje specifična protitelesa za določen virus. Ko se hemaglutinacijsko aktivni virus inkubira s specifičnimi protitelesi se le ta vežejo na virus in preprečujejo vezavo virusa na eritrocite, ki se jih naknadno doda v reakcijo. S testom lahko določimo titer protiteles in vrsto protiteles proti kateremu podtip virusa AI delujejo. Z rutinsko diagnostiko AI ugotavljamo predvsem prisotnost protiteles proti podtipoma H5 in H7.

 

ELISA

Encimsko imunski test je hitra in občutljiva metoda, ki se jo lahko uporablja kot presejalni test za ugotavljanje tipa A influence, lahko pa s tem testom ugotavljamo tudi posamezne podtipe npr. H5 in H7. Metoda temelji na vezavi specifičnih protiteles na virusne proteine AI.

 

Zakonodaja

Povezave